ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要

ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求：

(1)來源方便，易于純化;

(2)比活性高，性質穩定;

(3)酶活性和量能

用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(zui高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。

HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:

HRP2 ~2 y( w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB(3.3-二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少應用。OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產物不穩定，需要在短時間內進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體。

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經較短時間反應后呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色。

酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結合。后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。

ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要